Proteiners struktur og funktion
 
 


Læsestof, side  44 -   57 i Biokemi og molekylærbiologi, Jens Bremer, Nucleus 1989
               side 210 - 222 i Livet skal leves bd. 3, N.Roholt et al, Nucleus 1990

Proteiner spiller afgørende roller i næsten enhver biologisk proces. De er på en eller anden måde afgørende for fysiologiske funktioner som: 

Enzymatisk katalyse - næsten alle biologiske reaktioner er katalyseret af enzymer.
Enzymer øger de biologiske reaktioner fra 10 til 106 gange!
Der er i dag opdaget adskillige tusinde enzymer.
 
Transport og oplagsnæring - små molekyler transporteres ofte af proteiner (for eksempel, proteinet hæmoglobin der transporterer oxygen ud til vævene).
Mange af de molekyler vi indtager f.eks. som medicin transporteres helt eller delvis bundet til
serum albuminerne i blodplasma.
   
Koordineret bevægelse - muskler består overvejende af proteiner og muskelsammentrækninger foregår ved at to proteinfilamener - aktin og myosin - glider ind mellem hinanden.
 
Mekanisk støtte - hud og knogler bliver forstærket af proteinet kollagen.
 
Immun beskyttelse - antistoffer er proteinstrukturer, der søger for at reagere med specifikke fremmede stoffer i legemet.
  
Dannelse og transmission af nerveimpulser - nogle aminosyrer fungerer som neurotransmittere, som transmitterer elektriske signaler fra en nervecelle til en anden. Hertil kommer, at receptorer for neurotransmittere, medicin, osv. er proteiner af natur.
Et eksempel på dette er
acetylcholin receptoren, som er en proteinstruktur, der ligger indlejret i postsynaptiske neuroner.
  
Vækstkontrol og celledifferentiering - proteiner kan være helt afgørende for kontrollen af cellevæksten, celledifferentiering og at DNA kommer til udtryk, f.eks. kan repressor proteiner binde sig til specifikke stykker af DNA og herved forhindre at gener i dette område på DNA-molekylet og dermed deres produkter kommer til udtryk. Mange hormoner og vækstfaktorer, der regulerer cellernes funktion, er også proteiner, f.eks. insulin eller thyroid stimulerende hormon.

Proteiner er, ligesom de fleste biologiske makromolekyler, sammensat af simplere byggesten. Hos proteinerne kaldes byggestenene aminosyrer. Som vist herunder er amino- og carboxylsyregrupperne sat på et alfa-carbon, hvorpå der også sidder en R-gruppe (R = radikal). Det er R-gruppens kemiske sammensætning, der bestemmer den enkelte aminosyres identitet.

Det er ialt 20 forskellige aminosyrer, der opbygger alle former for proteiner (der findes modificerede eller på anden måde specielle aminosyrer, som vi senere skal se).
I opløsning ved
fysiologisk pH (7,4) undergår aminosyrerne en syre-basereaktion, så der dannes zwitterioner (amfolytter).
I en zwitterion ophæver + og - ladningerne hinanden med en nettoladning på 0
. pKa værdierne for en typisk aminosyrer er imidlertid - f.eks. for glycin er 9,6 og 2,3 for henholdsvis amino- og carboxylgrupperne.

Hvis pH for en aminosyrer sænkes betydeligt under 7,4, dannes der et aminosyremolekyle, der har en positivt ladet aminogruppe medens carboxylgruppen er neutral.
Hvis pH på lignende måde hæves fra 7,4, vil der dannes et molekyle i hvilket aminogruppen er neutral medens carboxylgruppen har en negativ ladning. Ioniseringstilstanden af aminosyrer er således pH-afhængig.

Alle aminosyrer, undtaget glycin hvor R = H, har et asymmetrisk C-atom.
Alle aminosyrer hos pattedyr findes i den såkaldte L-konfiguration, hvor "L" fortæller, at aminosyren i en
Fischer projektion ligner L-glyceraldehyd. Denne beskrivelse af stereokemien er imidlertid forældet, og benyttes sjældent med undtagelse af i trivial-navne.
Alle naturlige aminosyrer findes imidlertid også i
S-konfigurationen, der er baseret på en priorientering baseret på Cahn-Ingold-Prelog reglerne.

Som nævnt er det 20 forskellige aminosyrer, der i forskelligt mængdeforhold bruges til at opbygge proteinerne. De enkelte aminosyreres egenskaber er dikteret af sidegruppen - radikalet - som kan variere i størrelse, form, ladning, reaktionsvillighed og evne til at danne hydrogenbindinger.

Aminosyrernes grupperes i overensstemmelse med deres radikalers egenskaber, som vist i figuren herunder.
Hver aminosyrer har en standard betegnelse på 3 bogstaver.

De første seks aminosyrer - glycin (Gly), alanin (Ala), leucin (Leu), isoleucin (Ile), prolin (Pro) og valin (Val) - har radikaler, der er alifatiske af natur.
Glycin og alanin er for små molekyler til at have nogen hydrofob virkning på proteinerne, men de betragtes alligevel som alifatiske aminosyrer.
Prolin er også alifatisk og på grund af molekylets cykliske struktur, kan det ofte findes i bøjninger i en proteinkæde.
Valin, leucin og isoleucin er hydrofobe alifatiske, og selv om de kan findes et hvilket som helst sted i en proteinkæde foretrækker de at klumpe sig sammen inde i tertiærstrukturen væk fra vandet. Denne effekt skaber en betydelig stabilitet i proteinstrukturen.

Tre aminosyrer har aromatiske radikaler.
Det er
phenylalanin (phe), tyrosin (tyr) og tryptophan (trp).
Disse aminosyrer har radikaler, som indeholder delokaliserede
pi elektroner, som kan reagerer med andre pi systemer i biomolekyler. Hertil kommer, at den fenoliske hydroxyl på tyrosin kan ioniseres under fysiologiske forhold, og således øge opløseligheden i vand.

To af aminosyrerne indeholder svovl (S) i deres radikaler.
Det er
cystein (cys) og methionin (met).
Disse aminosyrer har specielle egenskaber, som senere skal beskrives.

Endelig er der to hydoxyl-holdige aminosyrer, serin (ser) og threonin (thr). Disse to aminosyrer har sidekæder (radikaler), som via hydrogenbindinger kan binde sig til vand eller til andre grupper på nabo makromolekyler. 

Fem af de 20 aminosyrer er hydrofile, dvs. de er i stand til at blive ioniserede ved fysiologisk pH.

Aminosyrerne lysin (lys), arginin (arg) og histidin (his) er basisk hydrofile, da de indeholder radikaler, der vil være positivt ladede ved pH = 7,4.

Aminosyrerne asparaginsyre (asp) og glutaminsyre (glu) er sure hydrofile, da deres sidekæder indeholder syregrupper, der har en negativ ladning ved pH=7,4. Disse to aminosyrer har også deres amid-holdige modstykker nemlig asparagin (asn) og glutamin (gln). 

Bemærk at 8 af de 20 aminosyrer har ioniserbare sidekæder.
Arginin, lysin og histidin kan have en positiv ladning, medens asparaginsyre og glutaminsyre kan have en negativ ladning under fysiologiske forhold.
Det er også muligt at serin, tyrosin og cystein kan ioniseres med en negativ ladning under visse biologiske processer.

Proteinkæder holdes sammen af peptidbindinger, som er simple amid-bindinger mellem nabo aminosyrer.
Når to aminosyrer reagerer med hinanden opstår der en ligevægt mellem frie aminosyrer og et peptidmolekyle, hvor de to aminosyrer er forbundet, så de danner et dipeptid. Da denne ligevægt favoriserer de frie aminosyrer, er det klart, at
dannelsen af en peptidbinding kræver energi.

Når nogle få aminosyrer er forbundet med hinanden, kaldes resultatet et oligopeptid.
Polypeptider er generelt sammensat af mellem 50 og 2000 aminosyrer. Deres molekylvægt udtrykkes i Dalton, hvor én Dalton svarer til 1 atom masseenhed (dvs. vægten af et hydrogenatom).1000 Dalton kaldes en kilodalton (kD). De fleste proteinmolekyler vejer mellem 5.500 og 220.000 Dalton. 

Hver peptidkæde har to frie ender, en amino-ende, der per konvention altid skrives til venstre, og en carboxylsyre-ende, der altid skrives til højre. Denne konvention benyttes også når en peptidkæde beskrives ved hjælp af 3 bogstavs-forkortelserne. Således har oligopeptidet Ala-Gly-Trp-Ser-Glu en alanin i amino-enden og en glutaminsyre i carboxylsyre-enden. Alanin kaldes derfor også aminosyre nr. 1 i peptidkæden og glutaminsyre er nr. 5.

Som vist herunder, kan aminosyrer indgå i reaktioner selv efter, at de er blevet placeret i en peptidkæde. Det er altså modifikationer, der finder sted efter translationen i proteinsyntesen. Ændringerne er altså modifikationer efter translationen. De kan være af enorm biologisk betydning. Et eksempel på modifikation efter translationen er dannelsen af svovlbroer mellem to cysteiner, så der dannes en ny aminosyre, der kaldes cystin. Denne modifikation sker ofte i ekstracellulære proteiner, og kan bidrage til dannelsen af deres tredimensionelle struktur.

Der er andre modifikationer efter translationen, der er af biologisk betydning, hvoraf tre vises herunder.
Hos nogle proteiner forekommer der en
acetylering af amino-enden. Denne ændring svækker stærkt proteinnedbrydningen, eftersom mange proteaser kræver en amino-ende for at reagere.
Hos struktur-proteiner som f.eks. kollagen sker der en
hydroxylering af prolin, så der dannes hydroxyprolin (HPRO). Da hydroxyprolin har en sidekæde der kan danne en hydrogen-binding, benyttes den til give kollagenstrukturen yderligere styrke, dvs. til sener og lignende væv.
Endelig kan aminosyrerne serin, threonin og tyrosin
phosphoryleres, når de sidder i en proteinkæde. Denne modifikation benyttes ofte af cellen til starte eller stoppe vigtige biologiske processer.

Ud over modifikationerne efter translationen, der er nævnt ovenfor, dannes nogle proteiner i inaktive former, der kaldes pro former. F.eks. dannes nogle enzymer som inaktive proenzymer, og trimmes senere af en peptidase så det aktive enzym dannes. Den del af enzymkæden, der fraspaltes under trimningen, bliver hydrolyseret og aminosyrerne bliver genbrugt.

Et stykke historie:

I 1953 udførte Frederich Sanger en række vigtige eksperimenter med hormonet insulin, hvormed han påviste mange kendsgerninger vedrørende proteinernes opbygning og struktur. Hans eksperimenter viste at proteiner har en unik aminosyre-sekvens; alle molekyler af et givent protein er identiske og sekvensen af hvert forskellig protein er unik. Han viste også for første gang at alle aminosyrer i proteiner fra pattedyr er i S-konfiguration, at peptidbindingen er en amid-binding, og at aminosyrer har alfa- aminogrupper og alfa carboxylgrupper.

Vi ved, at proteiner dannes når et stykke DNA aflæses (ved transkription) så der dannes et stykke komplementært messenger-RNA. Dette mRNA bruges dernæst til at fortælle ribosomerne, hvorledes aminosyre sekvensen i et protein skal være; denne proces under protein-dannelsen kaldes translationen. Aminosyresekvensen i et protein ligger således indkodet i DNA. Med andre ord er koden til en aminosyresekvens identisk med et gen.

Aminosyresekvensen i et peptid er også vigtig af følgende grunde: 

Kendskab til en peptidsekvens kan hjælpe med til at bestemme mekanismen bag et proteins funktion. For eksempel indeholder bindingssteder på et protein ofte aminosyrer med hydrogenbindinger som f.eks. serin.
 
Samspillet mellem aminosyrer i et protein kan hjælpe med til at afdække den 3-dimensionale struktur. For eksempel når to cysteiner krydsforbindes så der dannes cystin ("svovlbro"), hvorved der dannes en løkke på peptidkæden. Insulin består f.eks. af to kæder, der holdes sammen af 2 svovlbroer.
 
Variationer i aminosyre sekvensen hos visse proteiner kan forårsage sygdomme. Substitution af en Val med en Gly på et bestemt sted i hæmoglobinmolekylet kan f.eks. resultere i en mutant form for hæmoglobin, der kaldes hæmoglobin S. Denne defekt, der forårsages af en genetisk mutation resulterer i sygdommen seglcelle anæmi, fordi hæmoglobin S ikkke kan transportere oxygen så effektivt som regulær hæmoglobin. Eftersom hæmoglobin indeholder 574 aminosyrer og har en molekylvægt på 63 kD, kan man konkludere, at selv en meget lille variation i sstrukturen kan have en stor effekt på den biologiske aktivitet! 

Peptidbindingen har nogle karakteristika som bidrager til proteinernes endelig struktur. Peptidbindingen er stiv og kan derfor ikke frit rotere. Stivheden opstår fordi amidbindingen indgår i en tautomerisation, der giver den karakter af en stiv dobbeltbinding. De andre bindinger i et peptid er ikke stive, og de kan frit rotere, hvilket giver proteinkæden mange grader af rotationsfrihed. Amidbindingen sammen med bindingerne på hver side af den, som er forbundet med alfa-carboner kaldes rygraden i proteinkæden.  

Proteiner har i alt fire strukturniveauer, som defineret herunder:

Primær strukturen - hermed refereres der til aminosyre-sekvensen i et protein indbefattet de cystiner, der dannes under etableringen af svovlbroer. Sekvensen kan diktere den 3-dimensionelle struktur eftersom aminosyre byggestenene skal sidde i en helt bestemt rækkefølge for at få de rigtige proteinsammenfoldninger, og eftersom disulfiderne skal dannes ud fra de rigtige placeringer af cysteiner for at danne et aktivt protein.
Et eksempel på primær strukturen er
angiotensin II, som har sekvensen Asp-Arg-Val-Tyt-Ile-His-Pro-Phe.
 
Sekundær strukturen - udtrykket referere til arrangementet af aminosyrer der er lukket sammen i en kæde. Eksempler på sekundær strukturen er helixer og foldebladsstrukturer.
En
alfa helix er en tæt snoet, trådformet struktur med et gennemsnit på 3,6 aminosyrer per vinding. Helixen stabiliseres af hydrogenbindinger mellem carbonylgruppen i rygraden fra en aminosyre med NH i rygraden på en aminosyre, der sidder 4 pladser væk. Alle amino- og carboxylgrupper, der er placeret i hovedkæden, er hydrogen bundet og R-grupperne stikker ud fra strukturen i et spiral arrangement.
Foldebladsstrukturen, der er en beta konfiguration, er den anden type sekundærstruktur; den er sammensat af to eller flere lige kæder, der er bundet til hinanden side ved side via hydrogenbindinger.
Hvis amino-enden er i den samme ende hos alle kæderne kaldes foldebladet
parallel, og hvis kæderne løber i modsat retning (amino-enderne i modsatte side), kaldes foldebladet antiparallel. Foldeblade kan dannes ud fra en enkelt peptidkæde, hvis den indeholder en beta vending, som danner en hårnålelignende struktur. Man finder ofte aminosyren prolin i en beta vending, da den laver en løkke i kæden.
 
Tertiær strukturen - hermed betegnes en ret kompakt sammenrullet kugleformet struktur - en globulær struktur. Dvs. et protein kan folde sig sammen i en tre dimensionel form med en tydelig yderside og inderside.
Det indre af et proteinmolekyle indeholder overvejende
hydrofobe aminosyrer, der har tendens til at klumpe sig sammen og udelukke vand. Kernen i proteinmolekylet bliver stabiliseret af Van der Waalske kræfter og hydrofobe bindinger.
Modsat er det ydre af det globulære proteinmolekylet overvejende sammensat af
hydrofile aminosyrer, som er ladede eller i stand til at danne hydrogen-bindinger med vand. Det gør det muligt for proteinet at have en stor vandopløselighed. Et protein vil spontant folde sammen for at bevare de egenskaber, der er beskrevet ovenfor.
 
Kvartær strukturen - proteinkæder og globulære former kan forbinde sig med andre proteinkæder og globulære protrinrt hvorved der kan dannes dimerer, trimererer og andre oligomerer af højere orden. Generelt består de af mellem 2 og 6 subenheder, som kan være kæder med samme sekvens (homodimerer) eller forskellige kæder (heterodimerer).  
 

Proteiner indgår i cellemembraner hvor de rent faktisk udføre næsten enhver membranfunktion.
Det er interessant, at membranproteiner har de specielle egenskaber, der gør det muligt for dem at eksistere i dette lipid-miljø.

Proteiner, der sidder på overfladen af membranens yder- eller inderside, kaldes ekstrinsiske eller perifere, og har en stor procentdel af hydrofobe aminosyrer i den del af molekylet, der er tæt bundet til den hydrofobe membranstruktur. Aminosyrerne i den ydre del af proteinet, der er i kontakt med cytoplasmaets vandmiljø eller vandet i det ekstracellulære miljø, er overvejende hydrofile, der gør det muligt for proteinet at tilpasse sig vandet.

Proteiner kan også være placeret på tværs af membranen, i dette tilfælde kaldes de intrinsiske eller integrerede.
Den del af proteinmolekylet, der passerer gennem membranen er sammensat af hydrofobe aminosyrer, medens de indre og ydre dele overvejende er opbygget af hydrofile aminosyrer.

Transmembran proteiner kan flytte sig til siden i membranen, men kan ikke lavet et "flip-flop".

Proteiner er en enestående klasse af biomolekyler, der kan genkende og reagerer med forskellige stoffer.
Proteinmolekylet indeholder
komplementære kløfter og overfladestrukturer, som er designet til at binde sig til specifikke molekyler. Ofte er det kun et specielt molekyle eller isomér, der kan binde sig til en komplementær proteinoverflade. Når bindingen har fundet sted, er der dannet et såkaldt kompleks. Det bevirker en ændring i konformationen, en ændring der kan fungere som et signal inde i cellen eller evt. aktivere et enzym.


Metoder til isolering og oprensning af proteiner

Der findes en række eksperimentelle metoder, som kan bruges til at bestemme peptider og større proteinmolekyler. Seks af disse metoder beskrives nedenfor. 
 

1. Enzymatisk spaltning - En peptidkæde kan spaltes på specifikke steder ved at benytte enzymer, der kaldes peptidaser.
En af det mest almindelige peptidaser er
trypsin, som spalter en peptidkæde på carboxyl siden af lysin eller arginin. Således spaltes sekvensen Prp-His-Arg-Gly-Gly til Pro-His-Arg og Gly-Gly.
En anden almindelig peptidase er
chymotrypsin, der spalter kæden på carboxyl siden af hver aromatisk aminosyre (Trp, Tyr, Phe). Sekvensen Gln-Ser-Phe-Asp-Gly-Tyr-Thr bliver således spaltet til Gln-Ser-Phe, Asp-Gly-Tyr og Thr.  
  
2. Elektroforese - Elektroforese er en metode, hvorned man skiller proteiner ad ved at få dem til at vandre i et elektrisk felt. Det gøres normalt på en gel lavet af polyacrylamid.
Der sendes en strøm igennem gelen og proteinerne vandrer fra katoden til anode.
I
natrium dodecyl sulfat (SDS) elektroforese, behandles proteiner med blødgøringsmidlet SDS og mercaptoethanol for at denaturere dem og bryde svovlbroerne (disulfid-bindingerne). Dernæst placeres proteinerne på gelen. Når strømmen sendes gennem gelen vil små peptider vandre hurtigst, som vist i diagrammet herunder:

En anden almindelig elektroforesemetode, kaldes isoelektrisk fokusering, fordi proteinerne vandrer indtil de når elektroneutralitet.
Tag f.eks. et protein, der har 50 ioniserbare sidekæder, 25 kan være positiv ladet og 25 kan være negative. Det
isoelektriske punkt (pl) er den pH-værdi hvor antallet af positive og negative ladninger er lig med nul. Ved det punkt er nettoladningen nul.
Ved isoelektrisk fokusering behandles en polyacrylamid gel med
ampholiner, som skaber en pH-gradient i gelens længderetning.
Som vist ovenfor, vil hver protein fokuseres på det punkt på gelen, hvor pH svarer til dets isoelektriske punkt, på hvilket tidspunkt proteinet holder op med at flytte sig. Da isoelektrisk fokusering er en
ikke-denaturing, kan den bruges til at isolere aktive proteiner i deres oprindelige form.
 

3. Edman degraderingen. Edman degradering er den klassiske metode, der benyttes til at bestemme aminosyresekvensen - primær strukturen - i et givent peptid/protein.
Amino-enden af peptidet behandles med
phenyl isothiocyanat (PITC), så der dannes et kompleks, som vist herunder.
Ved behandling med syre fjernes den første aminosyre ved fraspaltning og der dannes en
phenylthiohydantoin. Tilbage er nu peptidkæden med en aminosyte mindre og en ny amino-ende, der kan reagere med PITC.
Bemærk at radikalet hos phenylthiohydantoin er det samme som radikalet på den første oprindelige aminosyre.
Der er således 20 phenylthiohydantoiner, der kan dannes under Edman dergraderingen, en for hver af de 20 aminosyrer.
Gentagne behandlinger gør det muligt for hver aminosyre i kæden at blive identificeret ved at isolere dens phenylthiohydantoin.
Proceduren udføres i dag hurtigt og effektivt med en
automatiseret sekvens maskine.
Peptider kan også syntetiseres ved en automatiseret proces.
Disse peptider bliver konstrueret på små kugler-"perler"- lavet af
polystyren i en proces, der kaldes fast fase syntese.
Som vist herunder reagerer perlen med carboxyl-enden på en aminosyre på hvilken der er påsat en
beskyttende gruppe som N-Boc for at forhindre amin-gruppen i at reagere for tidligt.
Når aminosyren er hæftet til perlen behandles amino enden med syre hvorved beskyttelsen forsvinder, og der dannes en peptidbinding med en anden aminosyre.
Sammenkoblingen af disse to aminosyrer sker under tilstedeværelsen af dicyclohexylcarbodiimid som bevirker dannelsen af amidet.
 

Cyklus med at fjerne den beskyttende gruppe og tilføjelse af aminosyrer fortsættes indtil det ønskede peptid er dannet, hvorefter peptiden frigøres fra perlen ved hjælp af HF.
 
 

4. Ion udvekslings kromatografi - Ion udvekslings kromatografi adskiller proteiner basret på deres ladning, som vist herunder.
Der findes to metoder der kaldes henholdsvis
anion udveksling (vist herunder) og kation udveksling.
Ved anion udvekslings kromatografi tilføres et protein til en kolonne fyldt med perler som har en positiv ladet gruppe som diethylaminoethyl. De negative ladninger på proteinet erstatter den modsat ladede ion (chlor er vist) og hæfter sig til perlen. Dernæst "vaskes" kolonnen ved hjlæp af en anden negativ ion. Natriumchlrod i en koncentrationsgradient benyttes almindeligvis hertil, og jo flere negative ladninger der er på proteinet, jo bedre klæber det og jo mere NaCl behøves for at erstatte det.
 
En kation udvekslingskolonner fungerer på samme måde med undtagelse af at perlerne er negativt ladede og proteinerne klæber sig ved hjælp af deres positivt ladede radikaler.

5. Affinitets kromatografi. Affinitets kromatografi benyttes til at isolere et specielt protein fra en blanding som vist i figuren her under.
En epoxysepharose gel får lov til at reagere med en ligand der har en affinitet over for det pågældende protein, og proteinblandingen tilføjes dernæst til kolonnen.
Kun det protein, der binder sig til liganden, vil blive hængende. Efter vask af kolonnen for at fjerne resten af proteinerne, vil det protein, man er interesseret i, blive udvasket ved hjælp af en salt-gradient.

6. ELISA-test (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay).

En ELISA-test, bygger på reaktionen mellem et forudbestemt protein og et
specifikt antistof, så der dannes et kompleks.
Metoden er ekstremt følsom, og den kan skelne mellem to proteiner, der kun er forskellige på en aminosyres plads.
Analysen kan varieres på mange måder, men kan typisk udføres på følgende måde:
 
En serum- eller blodprøve tilføres det specifikke antistof, som er bundet til et polymer, og det første kompleks dannes. Antistoffet, der selv sidder fast til polymeret, holder altså proteinet fast.
Et andet antistof, der er specifikt over for det protein, man er interesseret i, og som er bundet til et enzym - det er ofte peroxidase - tilføres dernæst, hvorved der dannes et kompleks (polymer-antistof-protein-antistof-enzym), der som beskrevet i den frie ende er bundet til et aktivt enzym (peroxidase).
Prøven skylles, så overskydende antistof-enzym skylles væk.
Mængden af enzym, der er tilbage bundet til proteinet via antistoffet, svarer nu til mængden af proteinmolekyler.
Derefter tilsættes en væske, der skifter farve eller fluorecerende, hvis det aktive enzym er tilstede.
Enzymet omdanner det ikke farvede eller fluorecerende substrat til et farvet eller fluorecerende produkt som kan måles. Jo mere farve, der dannes, jo mere af det pågældende protein er der til stede. Farveintensiteten måles i et fotometer.
Denne teknik er basis for mage diagnostiske tests, bl.a. graviditets-tests, hvor man måler mængden af human chorion gonadotropin.

ELISA-testen udføres på små plastikplader, hvorpå der er 96 "brønde" til de enkelte prøver. Der kan købes plastiplader, til den specifikke test man vil udføre.


Udvalgte eksempler på proteiners struktur og funktion

1. Renin-angiotensin-aldosteron systemet. Renin-angiotensin-aldosteron systemet benyttes af vores legeme til at regulere blodtrykket (se figuren neden for).
Som reaktion på et lavt blodtryk frigiver nyrerne proteasen
renin, som spalter det inaktive 14 aminosyrer store peptid angiotensinogen til et andet inaktivt peptid; decapeptidet angiotensin I.
Et andet enzym,
angiotensin omdannende enzym (AOE), omdanner dette decapeptid til dets aktive form; octapeptiden angiotensin II.
Angiotensin II er et meget aktivt karsammentrækkende stof, der er omkring 40 gange kraftigere i sin virkning end
norepinephrin til at øge blodtrykket. Hertil kommer, at angiotensin II fremmer frigørelsen af steroid hormonet aldosteron, der får nyrerne til at genoptage natrium og vand, og således øger blodtrykket ved en osmotisk effekt.
Angiotensin II bliver til sidst inaktiveret af en tredje peptidase, der kaldes
angiotensinase, som som gør hormonet inaktivt. 

Renin-angiotensin-aldosteron systemet spiller en afgørende rolle i udviklingen af en almindelig sygdom, der kades essentiel hypertension.
Når renin-angiotensin-aldosteron systemet er for aktivt, hæves blodtrykket og påfører blodkarrene øget stress.
Der er blevet udviklet en gruppe forbindelser, der fælles kaldes for
AOE inhibitorer som kan benyttes til en ret effektiv behandling af forhøjet blodtryk (hypertension). Eftersom forbindelserne (medicinen) forhindre at angiotensin I omdannes til angiotensin II, forhindrer de den stigning i blodtrykket, som er symptomerne på essentiel hypertension.

2. Oxytocin og Vasopressin. Oxytocin og vasopressin er to peptidhormoner med meget ens struktur, men med meget forskellig biologisk aktiviteter.
Deres primærsekvenser er vist nedenfor. Interessant nok er deres struktur kun forskellig på en aminosyres plads (den hydrofobe leucin nr. 8 i oxytoxin er erstattet med den hydrofile arginin i vasopressin).
Oxytocin er en kraftig
stimulator af livmoderens glatte muskulatur og stimulerer mælkeproduktionen.
Vasopressin der imod, der også er kendt som det
antidiuretisk hormon (ADH), har ingen virkning på livmoderens glatte muskulatur, men bevirker genoptagelsen af vand fra ultrafiltratet i nyrerne, hvorved blodtrykket øges.  

3. Insulin og glucagon. Insulin er et meget vigtigt peptid hormon, der produceres af beta-cellerne i de Langerhanske øer i bugspytkirtlen. Det består af 51 aminosyrer, tre disulfid-broer, og er sammensat af to adskilte kæder, der kaldes A og B. Insulin har en række vigtige virkninger på cellernes i vores krop:

1. Stimulation af glycolysen (nedbrydning af glucose).
2. Stimulation af glycogen dannelsen (oplagrinsform af glucose).
3. Øger stfskifteraten for dannelsen af fedtsyrere
4. Stimulation af glucosens optagelse i cellerne.
5. Overordnet reduktion af blodsukkerniveauet.

Insulin bliver ikke dannet i en aktiv form, men bliver først lavet som en enkelt inaktiv peptid-kæde, der kaldes præproinsulin (se figuren nedenfor). Præproinsulin har ingen disulfidbroer og ud over A og B kæden har den yderligere to dele, der kaldes signal sekvensen og forbindelses (C) peptidet.
Signal sekvensen informerer cellen om at der er ved at blive lavet insulin og at det færdige præproinsulin skal aflejres uden for cellen. C-peptidet er nødvendigt for at få præproinsulin til at folde i den korrekte konformation for til sidst at producere aktiv insulin.
Præproinsulin bliver
tilpasset af en to-trins procedure; i det første trin spaltes signalsekvensen af en peptidase og to af de tre disulfidbroer dannes, så der dannes et peptid, der kaldes proinsulin, som dog stadig er inaktivt.
En anden peptidase spalter dernæst C-peptidet, og der dannes en indre disulfidbro, hvorefter
insulin dannes som slutproduktet. 

Glucagon er et peptid hormon, der dannes i alfa cellerne i de Langerhanske øer i pancreas. Det er et peptid, der kun består af én kæde opbygget af 29 aminosyrer. Glucagon har den modsatte virkning af insulin:

Ned-regulering af glycolysen.
Øger hastigheden i glycogenolysen (glycogen nedbrydningen).
Reduktion i syntese raten af fedtsyrer.
En stigning af blodsukkerniveauet.

4. Hæmoglobin. Hæmoglobin A (HbA) er et tetramér protein, som består af to alfa kæder og to beta kæder, og som udgør 98% af menneskets hæmoglobin A.
Der er en
hæm-gruppe og ét oxygen bindings sted på hver af de fire underenheder; derfor kan hvert molekyle HbA transportere 4 molekyler oxygen. Der findes en anden form for human hæmoglobin A. Den mest almindelige er HbA2, der har to alfa kæder og udgør 2% af HbA.

Hæmoglobin er et eksempel på et allosterisk protein, dvs. dets funktion kan ændres ved at binde sig til nogle ude fra kommende forbindelser (der kaldes effektoren) på et sted på molekylet, der ikke er det aktive sted (det allosteriske sted).
Når en allosterisk effektor binder sig til et protein bevirker det en ændring i proteinets konformation, som enten får proteinet til at fungerer, eller hæmmer dets funktion, hvorfor man taler om (
positiv allosterisme) eller (negativ allosterisme). I hæmoglobinets tilfælde er den allosteriske effektor 2,3-diphosphoglycerat (2,3-DPG), som bevirker at hæmoglobin kun har en 1/26th af sin affinitet over for oxygen. Det er et vigtigt emne, eftersom 2,3-DPG i vævene udløser frigørelsen af oxygen på de rigtige steder i legemet. 

Hæmoglobin udviser også samarbejdsvillighed, som er et fænomen, hvor bindingen af et molekyle til et protein med mere end et aktivt sted, påvirker den lethed hvormed et efterfølgende molekyle binder sig.
Samarbedet - kooperationen - kan være
positiv (det andet molekyle binder sig lettere), eller negativ (det andet molekyle binder sig mindre let). I tilfældet med hæmoglobin, er bindingen af oxygen til de fire aktive steder på hæmoglobinmolekylet et eksempel på positivt samarbejde.

Som vist i figuren neden for kan hæmoglobin også eksistere i en glycosyleret form, der kaldes HbA1C.
HbA1C bliver dannet når amino-enden i HbA reagerer med glucose, det sker først reversibelt, hvorved der dannes en
aldimin eller Schiff's base, hvorefter den undergår et irreversibelt amadori rearrangement så resultatet bliver ketamin-formen HbA1C.
Hos normale patienter udgør HbA1C omkring 3-5% af HbA, men hos diabetikere, som har et hævet blodsukkerniveau i lange perioder, kan tallet være fra 6 til 15%.
Læger kan måle HbA1C, og benytter det som et troværdigt tegn på, hvor godt diabetikere klarer sig med den foreskrevne behandling. 

5. Kollagen. Kollagen er et protein i bindevæv og findes i hud, knogler, sener, brusk, hornhinden, osv.
Det er ret uopløseligt i vand, og er sammensat af to typer aminosyrekæder, der kaldes
alfa-1 og alfa-2.
I kollagens aminosyresekvens er omkring hver tredje aminosyre en Gly, og der er mange proliner, som er
hydroxylerede så der er dannet hydroxyprolin (HPRO).
Lysin aminosyrer er også hydroxylerede i kollagen, så der er dannet HLYS.

Disse ekstra sidekæder med OH gør kollagenet ekstra stærkt pga. H-bindinger og glycin grupperne gør det muligt for proteinet at sno sig meget tættere i sekundærstrukturen; det sker fordi de passer godt i formen til at være pakket på indersiden af helixen.
I en kollagen-fiber er tre af disse helixer snoet omkring hinanden, så der dannes en tov-lignende struktur, der kaldes en
superhelix. Det er denne tov-struktur, der giver kollagenet dets store styrke.

Kollagen-strukturen kan ødelægges under sygdomme som skørbug, der opstår på grund af mangel på ascorbinsyre (C-vitamin), der er en co-faktor under hydroxyleringen af prolin.
Hertil kommer, at kollagen-strukturen kan ødelægges under
rheumatoid artritis (kronisk ledegigt).

Retur til hovedsiden om proteiners struktur og funktion